Ungleiche allelische Expression in heterozygoten Patienten als Pathomechanismus für Hypertrophe Kardiomyopathie

In vorangegangenen Arbeiten konnte in unserer Abteilung gezeigt werden, dass Kardiomyozyten eines Patienten bei der gleichen Calciumkonzentration stark unterschiedliche Kräfte generieren. Wir haben die Hypothese aufgestellt, dass diese funktionelle Variabilität zwischen benachbarten Kardiomyozyten das zelluläre Netzwerk des Myokards zerstört und dadurch zu typischen Merkmalen der HCM wie zelluläres und myofibrilläres Disarray, Hypertrophie und Fibrose führt („contractile imbalance“ Hypothese).

In unserer Arbeitsgruppe haben wir Evidenz gefunden, dass einzelne Kardiomyozyten stark unterschiedliche Anteile an mutierter zu Wildtyp-mRNA exprimieren. Dazu haben wir einzelne Kardiomyozyten aus gefrorenen Herzgewebeproben mittels Lasermikrodissektion isoliert und mit einer allelspezifischen Einzelzell-RT-PCR analysiert. Wir konnten für β-kardiales Myosin (MYH7) und kardiales Troponin I (TNNI3) eine ungleiche allelische Expression von Zelle zu Zelle zeigen, einige Zellen exprimieren fast ausschließlich Wildtyp-mRNA, andere fast ausschließlich mutierte mRNA und wiederum andere Zellen exprimieren unterschiedliche Anteile beider Allele. Derzeit werden diese Analysen auch für induzierte pluripotente Stammzellen ausgeweitet.

Burst-like Transkription von HCM-Genen

Unsere Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass die Allele HCM-assoziierter Gene sowohl in HCM-Patienten als auch in herzgesunden Donoren „burst-like“ exprimiert werden. Im aktivierten Zustand werden beide Allele zufällig und unabhängig voneinander an- und ausgeschaltet. Durch single molecule RNA-Fluoreszenz in situ Hybridisierung (smRNA-FISH) an Gewebeschnitten und in induzierten pluripotenten Stammzellen konnten wir zeigen, dass in Zellen der gleichen Probe sowohl Nuklei ohne aktive Transkription vorlagen als auch Nuklei mit aktiver Transkription in einem oder beiden Allelen. Dies weist auf eine Transkription in bursts hin.

Weiterführende Arbeiten in diesem Projekt zielen auf Zellkulturmodelle zur in vivo Visualisierung der aktiven Transkription der Allele und zur gezielten Modulation der bursts und zur spezifischen Visualisierung von Wildtyp und mutiertem Allel.

Ursachen der allelischen Imbalance auf Gewebeebene

Bei einer rein stochastischen (burst-like) Expression beider Allele eines Gens wäre im Mittel ein 50:50 Verhältnis der mRNA beider Allele zu erwarten. Wir konnten jedoch für mehrere HCM-Mutationen zeigen, dass die Patienten abweichende Verhältnisse der beiden Allele exprimieren, sowohl auf mRNA als auch auf Proteinebene. Interessanterweise war das Verhältnis von Wildtyp zu mutierter mRNA für die meisten Mutationen in mehreren Patienten vergleichbar. So exprimierten z.B. alle von uns untersuchten Patienten mit der Mutation R723G im MYH7-Gen im Mittel 68% R723G und 32% Wildtyp-mRNA. Daher müssen neben der Transkription in bursts Mechanismen existieren, die die Expression der Allele beeinflussen. Diese könnten zum einen die Transkriptionsrate als auch die Degradationsrate eines Allels verändern. Am Beispiel der Mutation R723G konnten wir zeigen, dass die Mutation die Struktur der mRNA verändert. Dies könnte zu einer erhöhten Transkriptionsrate oder einer erhöhten Stabilität der mRNA führen. Diese Hypothesen überprüfen wir derzeit in Zellkulturmodellen.

Wissenschaftliche Mitarbeiter

Mariane Fráguas-Eggenschwiler

Technische Mitarbeiter

Karina Schlosser

FWJlerin

Mia Janna Prasse

laufende Qualifizierungsarbeiten

Masterarbeiten:

Lea Antonia Baschanow

Abgeschlossene Arbeiten

Dr. med. (StrucMed-Programm)
Felix Wilczak (Prof. Dr. J. Montag Medical School Berlin)
Philemon Libertus (Prof. Dr. J. Montag Medical School Berlin)
Benita Haß 

Bachelorarbeiten:

Luisa Schwarze (2023)

Wissenschaftliche Artikel in Fachzeitschriften

2023

• Nonsense mediated decay factor UPF3B is associated with cMyBP-C haploinsufficiency in hypertrophic cardiomyopathy patients, Valentin Burkart, Kathrin Kowalski, Alina Disch, Denise Hilfiker-Kleiner , Sean Lal , Cristobal dos Remedios, Andreas Perrot, Andre Zeug, Evgeni Ponimaskin, Maike Kosanke, Oliver Dittrich-Breiholz, Theresia Kraft, Judith Montag, Journal of Molecular and Cellular Cardiology Volume 185 (2023) pages: 26–37, https://doi.org/10.1016/j.yjmcc.2023.09.008, Online ahead of print

2022

• Transcriptional bursts and heterogeneity among cardiomyocytes in hypertrophic cardiomyopathy, Valentin Burkart, Kathrin Kowalski, David Aldag-Niebling, Julia Beck, Dirk Alexander Frick, Tim Holler, Ante Radocaj, Birgit Piep, Andre Zeug, Denise Hilfiker-Kleiner, Cristobal G. dos Remedios, Jolanda van der Velden, Judith Montag and Theresia Kraft, Front. Cardiovasc. Med.,  August 2022, Sec. Cardiovascular Biologics and Regenerative Medicin, doi: 10.3389/fcvm.2022.987889

2020

• Advanced Single-Cell Mapping Reveals that in hESC Cardiomyocytes Contraction Kinetics and Action Potential Are Independent of Myosin Isoform, Natalie Weber, Kathrin Kowalski, Tim Holler, Ante Radocaj, Martin Fischer, Stefan Thiemann, Jeanne de la Roche, Kristin Schwanke, Birgit Piep, Neele Peschel, Uwe Krumm, Alexander Lingk, Meike Wendland, Stephan Greten, Jan Dieter Schmitto, Issam Ismail, Gregor Warnecke, Urs Zywietz, Boris Chichkov, Joachim Meißner, Axel Haverich, Ulrich Martin, Bernhard Brenner, Robert Zweigerdt, Theresia Kraft, stem cell report, Published:April 16, 2020, DOI: https://doi.org/10.1016/j.stemcr.2020.03.015, Journal free

2018

• Burst-Like Transcription of Mutant and Wildtype MYH7 -Alleles as Possible Origin of Cell-to-Cell Contractile Imbalance in Hypertrophic Cardiomyopathy, Montag, J., Kowalski, K., Makul, M., Ernstberger, P., Radocaj, A., Beck, J., Becker, E., Tripathi, S., Keyser, B., Mühlfeld, C., Wissel, K., Pich, A., van der Velden, J., dos Remedios, C. G., Perrot, A., Francino, A., Navarro-López, F., Brenner, B., & Kraft, T. (2018). Front. Physiol. 9, 1–15. doi:10.3389/fphys.2018.00359

Veröffentlichte Abstracts für Vorträge 

Burkart V., Kowalski K., Holler T., Hilfiker-Kleiner D., Lal S., dos Remedios C. G., Perrot A., Ho C., Dittrich-Breiholz O., Kraft T., Montag J., MYBPC3-haploinsufficiency in hypertrophic cardiomyopathy patients is associated with nonsense mediated decay factor UBF3B. 2022, J Muscle Res Cell Motil

Montag J., Weber N., Kowalski K., Mayer A.-K., Iorga B., Brunkhorst A., Zweigerdt R., Kraft T., Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes mimic intercellular heterogeneity as pathomechanism in Hypertrophic Cardiomyopathy, 2022, Acta Physiologica, Vol.236, Issue S725

Burkart V., Kowalski K., Holler T., Hilfiker-Kleiner D., Lal S., dos Remedios C. G., Perrot A., Seidman C. E., Kosanke M., Kraft T., Montag J., Alterations of sarcomeric stoichiometry by nonsense mediated decay of MYBPC3-mRNA in hypertrophic cardiomyopathy patients with truncation mutations. 2022, Biophysical Journal, Vol.121, Issue 3, Suppl., 1, 435a

Kowalski K., Mayer A.-K., Piep B., Zweigerdt R., Schwanke K., Kraft T., Montag J. Burst-like transcription of MYH7 in Hypertrophic Cardiomyopathy patients is mimicked in patient-derived hPSC-CMs; Acta Biochimica Polonica, Vol. 68 No. S1, 57; 2021

Burkart V., Kowalski K., Beck J., Aldag-Niebling D., Radocaj A., Keyser B., van der Velden J., dos Remedios C., Hilfiker-Kleiner D., Kraft T., Montag J. Burst-like transcription of sarcomeric genes in hypertrophic cardiomyopathy. 2021, Biophysical Society Journal, Vol. 120, Issue 3, Suppl. 1, 103a 

Weber N.*, Kowalski K.*, Holler T., Radocaj A., Fischer M., de la Roche J., Thiemann S., Schwanke K., Lingk A., Krumm U., Piep B., Martin U., Zweigerdt R., Brenner B., Kraft T., In human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes twitsch kinetics, action potential parameters and MyH-mRNA fractions are independent of the expressed myosin heavy chain isoform, 2019, Biophysical Society Journal, Vol.116, Issue 3, Suppl. 1, 118A * gleichwertiger Beitrag der Autoren

Kowalski K., Radocaj A., Francino A., Navarro-López F., dos Remedios C. G., Kraft T., Brenner B. Detection of transcription sites in FHC patients indicating a burst-like transcription concept for MYH7. 2017, Acta Physiol. 219 (S711):47

Radocaj A., Kowalski K., Montag J., Kraft T., Brenner B. Independent Stochastic Burst-like Transcription of Mutant and Wildtype Alleles as Mechanism for Cell-to-Cell Functional Imbalance in Hypertrophic Cardiomyopathy. 2017, Biophysical Journal, Vol. 112, Issue 3, p164a

Kraft T., Kowalski K., Montag J., Radocaj A., Makul M., Ernstberger P., Perrot A., Francino A., Navarro-López F., Brenner B. Hypertrophic Cardiomyopathy: Random burst-like transcription of wildtype and mutated allele as trigger for phenotype development. 2016, Circulation, Vol. 134, Issue suppl_1

Veröffentlichte Abstracts für Poster

Kowalski K., Riesselmann J.N., Weber N., Piep B., Franke A., Martin U., Zweigerdt R., Kraft T.,  Presence of T3 reduces active transcription of MYBPC3 and TNNI3 in cardiomyocytes; 2022, J Muscle Res Cell Motil

Burkart V., Kowalski K., Beck J., Aldag-Niebling D., Holler T., Radocaj A., Keyser B., van der Velden J., Lal S., dos Remedios C., Hilfiker-Kleiner D., Kraft T., Montag J. Burst-like transcription of sarcomeric genes is associated with cell-to-cell allelic and functional heterogeneity in Hypertrophic Cardiomyopathy; Acta Biochimica Polonica, Vol 68 No. S1, 48; 2021

Kowalski K., Riesselmann J.N., Weber N., Piep B., Franke A., Martin U., Zweigerdt R., Kraft T., T3 reduces transcriptional activty of MYBPC3 and TNNI3. 2021, Acta Physiol.

Kowalski K., Riesselmann J.N., Weber N., Piep B., Franke A., Martin U., Zweigerdt R., Kraft T., Influence of T3 on active transcription of MYBPC3 and TNNI3. 2021, Biophysical Society Journal, Vol. 120, Issue 3, Suppl. 1, 136a

Burkart V., Beck J., Kowalski K., van der Velden J., dos Remedios C. G., Montag J., Kraft T., Unequal allelic expression of mutated cardiac troponin I from cell-to-cell may induce contractile imbalance in Hypertrophic Cardiomyopathy. 2020, Biophysical Society Journal, Vol.118, Issue 3, Suppl.1, 424a

Kowalski K., Weber N., Holler T., Radocaj A., Fischer M., de la Roche J., Thiemann S., Schwanke K., Piep K., Piep B., Lingk A., Krumm U., Martin U., Zweigerdt R., Brenner B., Kraft T., Twitch kinetics and action potential parameters are independent of expressed myosin heavy chain isoform in human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. 2019, Acta Physiol. 227 (S719):146

Burkart V., Beck J., Kowalski K., van der Velden J., dos Remedios C. G., Montag J., Kraft T., Allelic imbalance of TNNI3 trough burst-like transcription may lead to contractile imbalance in hypertrophic cardiomyopathy patients. 2019, J Muscle Res Cell Motil 40

Makul M., Radocaj A., Ernstberger P., Montag J., Kowalski K., Keyser B., Perrot A., dos Remedios C. G., Brenner B., Kraft T. Myosin and cMyBP-C-mutations in Hypertrophic cardiomyopathy: Variable effects on calcium sensitivity and contractile imbalance from cell-to-cell, 2019, Biophysical Society Journal, Vol.116, Issue 3, Suppl. 1, 262A

Weber N.*, Kowalski K.*, Holler T., Radocaj A., Schwanke K., Lingk A., Krumm U., Wendland M., Zywietz U., Chickov B., Ulrich M., Zweigerdt R., Brenner B., Kraft T. Human embryonic stem-cell derived cardiomyocytes: Single-Cell Mapping to relate twitch kinetics to myosin heavy chain protein and mRNA-expression, 2018, Biophysical Journal, Vol.114, Issue 3, p.549a * gleichwertiger Beitrag der Autoren

Kowalski K., Radocaj A., Francino A., Navarro-López F., dos Remedios C. G., Kraft T., Brenner B. Visualization of active transcription sites in human cardiomyocytes supports the concept of burst-like transcription of MYH7. 2017, Biophysical Journal Vol. 112, Issue 3, Supplement 1, 210a

Kowalski K., Radocaj A., Francino A., Navarro-López F., dos Remedios C. G., Kraft T., Brenner B. Analysis of active transcription sites in single human cardiomyocytes reveals burst-like transcription of MYH7. 2017, J Muscle Res Cell Motil 38:360

Radocaj A., Kowalski K., Montag J., Kraft T., Brenner B. Model of independent stochastic burst-like transcription can explain observed functional and transcriptional variability among cardiomyocytes from Hypertrophic Cardiomyopathy patients. 2017, J Muscle Res Cell Motil 38:362

Radocaj A., Kowalski K., Montag J., Kraft T., Brenner B. Independent, stochastic, burst-like transcription of mutant and wildtype MYH7-alleles. A mechanism for functional and transcriptional variability among HCM (hypertrophic cardiomyopathy) cardiomyocytes. 2017, Acta Physiol. 219(S711):132

Weber N., Kowalski K., Holler T., Lingk A., Radocaj A., Krumm U., Wendland M., Zywietz U., Chichkov B., Schwanke K., Martin U., Zweigerdt R., Brenner B., Kraft T. Singe cell mapping used to assign mRNA and protein expression of cardiac myosin heavy chain to twitch kinetics of the same human embryonic stem cell-derived cardiomyocyte. 2017, J Muscle Res Cell Motil 38:344

• Lasermikrodissektion
• (Einzelzell-) Reverse Transkriptase PCR (RT-PCR)
• single molecule RNA-Fluoreszenz in situ Hybridisierung (smRNA-FISH)
• Kontraktions- und Ca2+-Transientenmessungen mittels MyoCam (IonOptix)
• Genomeditierung, knock-in einer Punktmutation (CRISPR/Cas9)
• Zellkultur (hiPSC)

• Praktikum „Physiologie und physikalische Grundlagen der Medizin“ für Studierende der HM, ZM, Biologie
• Seminare „Physiologie und physikalische Grundlagen der Medizin“ für Studierende der HM
• Seminare mit praktischen Anteilen im Studiengang Hebammenwissenschaften
• Betreuung von Qualifizierungsarbeiten